一、雙酶切構建載體方法

　　首先，對引物的設計有著嚴格的要求，引物的長度一般為18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之間GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位點及保護性堿基。引物設計不當可能在擴增時生成引物二聚體，給實驗帶來不便。

　　其次，目的基因有必要進行TA克隆。在后續的實驗操作中，可能會由于酶切效率和連接效率低等原因使得載體構建相當困難，目的基因擴增在這些步驟之前，由于PCR擴增是體外擴增，很容易發生突變，TA克隆有著成功率高的優點，通過TA克隆將目的基因構建進pMD19T進而轉化入大腸桿菌中，單克隆菌體自身的修復機制可保證單一的克隆，利于篩選需要的序列，通過后續測序鑒定可以得到大量正確的目的基因片段，而且直接將PCR產物切下來不易產生粘性末端，連接入表達載體比較困難，通過TA克隆酶切的目的片段產生粘性末端的概率很高。

　　第三，雙酶切效率不高。由于不同的酶所對應的緩沖液不同，內切酶只有在緩沖液環境下效率才能得到優化，但是雙酶切體系勢必使其中一個酶的活性有所損失。這樣必定會使酶切產物不純。酶切產物中既有單酶切線性載體，也有雙酶切線性載體，使得連接時所需要的雙酶切線性載體的量失準，影響連接效率。因此可以先用一個控制性內切酶切割純化回收，但工作量較大，回收率低。

　　第四，連接效率低。pMIR reporter與目的片段的摩爾比很重要，一般在3:1-10:1間浮動，而且連接效率和連接反應體積也有關系。

　　二、同源重組法構建載體

　　采用同源重組法構建載體與常規雙酶切構建載體方法不同。首先，設計引物時上游引物5’端前面加的是酶切位點（如 Hind III）及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應前面的15個堿基載體片段，下游引物5’端前面加的是HindIII酶切位點及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應后面的15個堿基載體片段，如此設計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確。其次，載體只需要單酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點的線性載體。相比雙酶切切割載體，單酶切可以保證酶切后的載體都是單一的線性片段，使得后續的重組連接更準確。第三，省去了TA克隆環節。因為PCR產物可以直接用于重組連接，不需要酶切產生粘性末端，而且重組酶的重組能力強于T4DNA連接酶的連接能力，一般只需要一步即可重組連接成功，因此可以在重組反應之后進行測序鑒定。