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      服務項目
      質粒構建
      發布時間:2021-05-13   瀏覽:2142次

        一、雙酶切構建載體方法

        首先,對引物的設計有著嚴格的要求,引物的長度一般為18-25bp,GC含量控制在40%-60%,上、下游引物之間GC含量不能相差太大,引物中需要加入酶切位點及保護性堿基。引物設計不當可能在擴增時生成引物二聚體,給實驗帶來不便。

        其次,目的基因有必要進行TA克隆。在后續的實驗操作中,可能會由于酶切效率和連接效率低等原因使得載體構建相當困難,目的基因擴增在這些步驟之前,由于PCR擴增是體外擴增,很容易發生突變,TA克隆有著成功率高的優點,通過TA克隆將目的基因構建進pMD19T進而轉化入大腸桿菌中,單克隆菌體自身的修復機制可保證單一的克隆,利于篩選需要的序列,通過后續測序鑒定可以得到大量正確的目的基因片段,而且直接將PCR產物切下來不易產生粘性末端,連接入表達載體比較困難,通過TA克隆酶切的目的片段產生粘性末端的概率很高。

        第三,雙酶切效率不高。由于不同的酶所對應的緩沖液不同,內切酶只有在緩沖液環境下效率才能得到優化,但是雙酶切體系勢必使其中一個酶的活性有所損失。這樣必定會使酶切產物不純。酶切產物中既有單酶切線性載體,也有雙酶切線性載體,使得連接時所需要的雙酶切線性載體的量失準,影響連接效率。因此可以先用一個控制性內切酶切割純化回收,但工作量較大,回收率低。

        第四,連接效率低。pMIR reporter與目的片段的摩爾比很重要,一般在3:1-10:1間浮動,而且連接效率和連接反應體積也有關系。

        二、同源重組法構建載體

        采用同源重組法構建載體與常規雙酶切構建載體方法不同。首先,設計引物時上游引物5’端前面加的是酶切位點(如 Hind III)及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應前面的15個堿基載體片段,下游引物5’端前面加的是HindIII酶切位點及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應后面的15個堿基載體片段,如此設計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確。其次,載體只需要單酶切,用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點的線性載體。相比雙酶切切割載體,單酶切可以保證酶切后的載體都是單一的線性片段,使得后續的重組連接更準確。第三,省去了TA克隆環節。因為PCR產物可以直接用于重組連接,不需要酶切產生粘性末端,而且重組酶的重組能力強于T4DNA連接酶的連接能力,一般只需要一步即可重組連接成功,因此可以在重組反應之后進行測序鑒定。

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