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      服務項目
      CRIEPR/Cas9
      發布時間:2021-05-13   瀏覽:2093次

        CRISPR-Cas9系統是細菌在與噬菌體抗爭的進化過程中產生的一種抵御外源DNA入侵的機制,能有效識別并剪切外源DNA?;谄渥R別切除外源DNA的原理,CRISPR-Cas9系統被開發成為新一代基因編輯工具。與ES打靶、ZFN、TALEN等技術途徑相比,CRISPR-Cas9系統操作簡便、效率高、成本低,有著極其廣闊的應用前景。

        CRISPR RNA(crRNA):指的是一個含有42個堿基的小RNA,它的5’是20個可以和目標DNA配對的堿基,所以是可變的;它的3’是22個不變的堿基,術語叫”repeat”

        trans-activating crRNA (tracrRNA):指的是一個大概含有87個堿基的小RNA,它的5’可以和crRNA的3’“repeat”配對,術語叫做”anti-repeat”,除此之外,其它部分可以形成hairpin樣的二級結構。

        crRNA和tracrRNA結合在一起后可以與Cas9結合,然后通過那20個可變的RNA識別含有PAM的genomic DNA。

        CRISPR-Cas9系統的一大改進是,將crRNA、tracrRNA所組成的雙鏈RNA結構改造成為發夾樣的單鏈導向RNA(Single-guideRNA,sgRNA/gRNA)。其中,gRNA5′端的前20個核苷酸相當于crRNA序列,可以與靶基因片段互補結合,gRNA同樣能夠指導Cas9蛋白特異切割雙鏈DNA,進一步簡化了CRISPR-Cas9系統的操作環節.

        Cas9識別位點的特異性就由20個堿基的向導序列和3個堿基的PAM序列共同決定。一旦基因組序列中出現由于gRNA引導的Cas9切割DNA斷口,細胞內的非同源末端連接修復機制和同源重組修復機制就會啟動,而非同源末端連接修復機制會造成基因組序列的突變和移碼,從而有一定概率出現目的基因的序列突變和蛋白翻譯提前終止。

        CRISPR/Cas9是一種能夠對任何物種基因組的特定位點進行精確編輯的技術。使用該技術能夠進行細胞水平和動物水平的單基因或多基因的組成型/條件性/組織特異性敲除,敲入或定點突變。其原理是Cas9蛋白通過導向性RNA(guideRNA,gRNA)識別特定基因組位點并進行剪切。

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